Effect of antioxidants on human primary and metastatic colon cancer cells at hypoxia and normoxia

Magdalena Mielczarek-Puta, Alicja Chrzanowska, Dagmara Otto-Ślusarczyk, Wojciech Graboń,
Anna Barańczyk-Kuźma

Katedra i Zakład Biochemii, Warszawski Uniwersytet Medyczny, warszawa, Polska

Streszczenie

Cel: Zbadanie wpływu wybranych antyoksydantów na przeżywalność i proliferację komórek raka jelita grubego w różnych stężeniach tlenu.

Materiały i metody: Ludzkie komórki raka pierwotnego (SW480) i przerzutowego (SW620) jelita grubego hodowano w hipoksji (1% tlenu), normoksji tkankowej (10% tlenu) i atmosferycznej (21% tlenu) bez badanych związków (kontrola) i w obecności kwercetyny, galusanu epigallokatechiny, kwasu α-liponowego, kwasu hydroksycytrynowego oraz mieszaniny wszystkich związków. Przeżywalność oznaczano metodą barwienia trypanem blue a proliferację testem MTT.

Wyniki: Przeżywalność komórek obu linii wynosiła od 80% do 97% i nie zależała od stężenia związku i dostępności tlenu. W hipoksji, w obecności każdego z badanych związków liczba komórek obu linii była mniejsza niż w kontroli. W normoksji tkankowej liczba komórek raka pierwotnego spadała tylko w obecności galusanu epigallokatechiny, natomiast komórki przerzutowe były wrażliwe na wszystkie związki.

Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują, że badane antyoksydanty w stężeniach fizjologicznych nie działają cytotoksycznie na pierwotne i przerzutowe komórki raka jelita grubego, natomiast wywierają efekt cytostatyczny, który zależy od typu komórek, dostępności tlenu i stężenia związku.

Abstract

The aim: Evaluation of some antioxidants on human colon cancer cells viability and proliferation at various oxygen levels.

Material and Methods: Human primary (SW480) and metastatic (SW620) colon cancer cells were cultured at hypoxia (1% oxygen), tissues (10% oxygen) and atmospheric (21% oxygen) normoxia with quercetin, epigallocatechin gallate, lipoic acid, hydroxycitric acid, their mixture, and without studied compounds (control). Antioxidants were used at physiological concentrations. The cell viability was determined by trypan blue dye exclusion and proliferation by MTT assay.

Results: The viability of each line ranged from 80% to 97%, and it was independent on the compound and oxygen availability. At hypoxia the cell count of both lines was lower than for the controls in the presence of each studied compound. At tissue normoxia the cell count of primary cancer cells was decreased only with epigallocatechin gallate, whereas metastatic cells were sensitive for each antioxidant.

Conclusions: Our results indicated, that the studied antioxidants were not cytotoxic at physiological levels for both pirmary and metastatic colon cancer. Their cytostatic effect depend on the type of cell, oxygen availability and antioxidant concentration.

Wiad Lek 2017, 70, 5, 946-952

WSTĘP

Antyoksydanty to związki chemiczne, które wykazują zdolność zmiatania reaktywnych form tlenu (RFT), hamowania ich produkcji lub aktywacji obrony antyoksydacyjnej organizmu. Do najważniejszych antyoksydantów nieenzymatycznych zalicza się flawonoidy, witaminy A, C, E, beta-karoten, oraz kwas α-liponowy [1].

Kwercetyna (Q; 3,3’,4’,5,7– pentahydroksyflawon) i galusan epigallokatechiny (EGCG; polifenol, pochodna katechiny) należą do najbardziej rozpowszechnionych flawonoidów w przyrodzie. Oba związki są obecne w dużych ilościach w zielonej herbacie i czerwonym winie, a kwercetyna także w cebuli, jabłkach, brokułach i jagodach. Kwercetyna stanowi 60−75% wszystkich flawonoidów znajdujących się w diecie i podobnie jak EGCG posiada wysoki potencjał redukcyjny oraz zdolność aktywacji enzymów antyoksydacyjnych. Oba flawonoidy chelatują jony metali przejściowych, hamują peroksydację lipidów i obniżają poziom tlenku azotu [2−5]. Kwercetyna jest inhibitorem dehydrogenazy mleczanowej, kinazy tyrozynowej, aminotransferazy asparaginianowej oraz transportera mleczanu MCT1 odpowiedzialnego za jego pozakomórkowy transport. EGCG działa jako inhibitor dehydrogenazy glutaminianowej − enzymu zaangażowanego w szlak glutaminolizy [6, 7].

Kwas α-liponowy (ALA) (kwas 1,2-ditiolano-3-pentanowy) jest ośmiowęglowym, naturalnie występującym nasyconym kwasem tłuszczowym. Pełni on rolę kofaktora w wieloenzymatycznych kompleksach dehydrogenaz katalizujących oksydacyjną dekarboksylację α-ketokwasów, takich jak dehydrogenaza pirogronianowa czy α-ketoglutaranowa. Charakteryzuje się wysoką biodostępnością i w wielu tkankach jest szybko redukowany do kwasu dihydroliponowego (DHLA). ALA i DHLA uważane są za uniwersalne antyoksydanty zdolne do reakcji z rodnikami ponadtlenkowymi, nadtlenkowymi, hydroksylowymi i tlenem singletowym, zarówno w fazie wodnej, jak i lipidowej. Ponadto wykazują aktywność chelatującą metale i działają synergistycznie z innymi antyoksydantami [8, 9].

Kwas hydroksycytrynowy (HCA) jest izolowany z owocu Garcinia cambogia. Powoduje on wzrost aktywności katalazy, poziomu zredukowanego glutationu i zahamowanie peroksydacji lipidów. Jego właściwości przeciwutleniajace są słabsze od związków wymienionych wyżej [4, 10]. Ponadto HCA jest kompetycyjnym inhibitorem ATP-zależnej liazy cytrynianowej, kluczowego enzymu zaangażowanego w biosyntezę lipidów i cholesterolu. Suplementacja diety solami wapniowo-potasowymi kwasu hydroksycytrynowego nasila β-oksydację kwasów tłuszczowych, obniża poziom cholesterolu całkowitego i frakcji LDL, podnosi poziom HDL w surowicy krwi oraz zwiększa uwalnianie serotoniny [11]. Wymienione związki poza właściwościami antyoksydacyjnymi odgrywają istotną rolę w szlaku glikolizy i glutaminolizy.

Naturalne antyoksydanty mają duże znaczenie w profilaktyce nowotworów, a odpowiednia dieta oraz suplementacja antyoksydantów powoduje osiąganie we krwi stężeń o potwierdzonym działaniu profilaktycznym [1]. Jednak wysokie stężenia tych związków stosowane powszechnie w badaniach prowadzonych na liniach nowotworowych wykazujące działanie cytotoksyczne nie zostaną nigdy osiągnięte in vivo nawet przy zastosowaniu intensywnej suplementacji.

Utrzymanie równowagi pomiędzy czynnikami utleniającymi a antyoksydantami jest ważnym aspektem zdrowotnym. Wiadomo, że wewnątrzkomórkowy poziom reaktywnych form tlenu RFT zależy od dostępności tlenu, z kolei ilość RFT może wpływać na rozwój komórek nowotworowych [12]. W litych guzach nowotworowych stężenie tlenu jest zmienne – od hipoksji do tzw. normoksji tkankowej, która w dobrze unaczynionych częściach guza nie przekracza 10% [13]. Pomimo tego, większość badań na liniach komórkowych prowadzona jest w 21% stężeniu tlenu (tzw. normoksja atmosferyczna), a więc w warunkach niewystępujących in vivo.

CEL PRACY

Celem obecnej pracy była ocena działania wybranych antyoksydantów na proliferację i przeżywalność ludzkich komórek raka jelita grubego przy prężności tlenu występującej w guzie in vivo. Działanie wybranych związków badano w stężeniach, które mogą być osiągnięte w surowicy krwi człowieka [14].

MATERIAŁY I METODY

Materiał badawczy stanowiły ludzkie komórki pierwotnego (SW480) i przerzutowego (SW620) raka jelita grubego. Komórki firmy ATCC (American Type Culture Collection) hodowano w MEM (Mininum Essential Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, buforu HEPES (20 mM), penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 μg/ml) w temperaturze 37ºC przy 5% nasyceniu CO2 do momentu osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie komórki (1×104) wysiewano na 96-dołkowe płytki i hodowano w MEM z dodatkiem dwóch stężeń pojedynczego antyoksydantu, a więc kwercetyny (Q; 2 µM i 4 µM), galusanu epigallokatechiny (EGCG; 2 µM i 4 µM), kwasu α-liponowego (ALA; 20 µM i 40 µM), kwasu hydroksycytrynowego (HCA; 15 µM i 30 µM) oraz mieszanina wszystkich badanych związków, odpowiednio w niższych (QEAH1) i wyższych stężeniach (QEAH2). Kontrolę stanowiły komórki hodowane w MEM bez dodatku badanych antyoksydantów.

W celu oznaczenia liczby żywych komórek hodowlę prowadzono przez 72 godziny w warunkach hipoksji tkankowej (1% O2), normoksji tkankowej (10% O2) oraz normoksji atmosferycznej (21% O2), w komorze hipoksyjnej z regulatorem natlenienia (Coy Laboratory Products INC). Liczbę komórek oceniano przy pomocy testu redukcji soli tetrazolowej (MTT) i określano na podstawie krzywej wzorcowej.

Do badania przeżywalności, którą oznaczano metodą barwienia błękitem trypanu (TB), komórki (4×104) wysiewano na 12-dołkowe płytki i hodowano w MEM z dodatkiem badanych związków przez 120 godzin w warunkach jak wyżej (hipoksji, normoksji tkankowej i atmosferycznej). Komórki liczono przy użyciu automatycznego licznika (Countess, Invitrogen), a przeżywalność wyrażano w procentach.

Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnie arytmetyczne z odchyleniami standardowymi (±SD). Istotność statystyczną różnic pomiędzy wartościami średnimi obliczano przy pomocy programu Statistica 12.0. (Astat Soft, Inc, USA). Do analizy zastosowano test t-Studenta i analizę wieloczynnikowej wariancji ANOVA. Poziom istotności przyjęto dla p<0,05.

WYNIKI

Wpływ antyoksydantów
na przeżywalność komórek
raka jelita grubego

Żaden z badanych związków nie wykazał działania cytotoksycznego. Przeżywalność komórek obu linii, we wszystkich stężeniach tlenu w obecności każdego z badanych związków oraz ich mieszaniny wynosiła od 80% do 97% i była podobna jak w kontroli (94−97%).

Wpływ antyoksydantów
na proliferację komórek SW480
w różnych stężeniach tlenu

W 1% hipoksji, w obecności wyższych stężeń każdego z badanych związków (Q, EGCG, ALA i HCA), a także ich mieszaniny (QEAH) liczba komórek SW480 była znamiennie mniejsza niż w kontroli (p<0,001) (Ryc. 1). Przy niższych stężeniach Q i ALA, nie ulegała ona zmianie, natomiast obniżała się w obecności niższych stężeń EGCG, HCA oraz mieszaniny badanych związków (p<0,05).

W normoksji tkankowej (10% tlenu), w obecności obu stosowanych stężeń Q, ALA i HCA liczba komórek SW480 była podobna jak w kontroli, podczas gdy w obecności obu stężeń EGCG i mieszaniny była znamiennie niższa (p<0,001) (Ryc. 1). W hodowli prowadzonej w obecności wyższych stężeń mieszaniny liczba komórek SW480 obniżała się ponad 6-krotnie w porównaniu do kontroli.

W normoksji atmosferycznej (21% tlenu) w obecności każdego ze stężeń pojedynczych antyoksydantów oraz ich mieszanin, liczba komórek SW480 była znamiennie mniejsza w porównaniu do kontroli (p<0,001, p<0,05), za wyjątkiem hodowli prowadzonej w obecności niższego stężenia HCA. Największe różnice stwierdzono w obecności wyższego stężenia HCA i wyższych stężeń mieszaniny, gdzie liczba komórek SW480 była mniejsza odpowiednio 3 i 5 razy w porównaniu do kontroli (p<0,001) (Ryc. 1).

Wpływ antyoksydantów
na proliferację komórek SW620
w różnych stężeniach tlenu

W hipoksji w obecności wyższych stężeń Q i ALA, każdego ze stężeń EGCG, HCA i mieszaniny liczba żywych komórek SW620 była znamiennie mniejsza w porównaniu do kontroli (p<0,001). Jedynie w hodowlach prowadzonych w obecności niższych stężeń Q i ALA nie wykazano istotnych statystycznie różnic w porównaniu do kontroli (Ryc. 1).

W normoksji tkankowej działanie antyproliferacyjne badanych związków wykazano wyłącznie w obecności ich wyższych stężeń. Przy tych stężeniach liczba komórek SW620 hodowanych w obecności Q i ALA była ponad 3-krotnie mniejsza, natomiast w obecności HCA i EGCG ponad cztero-, a nawet pięciokrotnie mniejsza w porównaniu do kontroli (p<0,001). Największy spadek liczby komórek zaobserwowano w hodowli prowadzonej w obecności mieszaniny wszystkich związków (spadek sześciokrotny) (p<0,001) (Ryc. 1).

W normoksji atmosferycznej liczba komórek SW620 była znamiennie niższa w obu badanych stężeniach związków (p<0,001) z wyjątkiem EGCG, który w niskich stężeniach nie miał wpływu na proliferacje.

Porównanie proliferacji komórek SW480 i SW620 w zależności od dostępności tlenu i stężenia antyoksydantu

Wieloczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazała, że szybkość proliferacji obu linii komórkowych jest różna i zależy od dostępności tlenu i stężenia antyoksydantów (Ryc. 2).

W hodowlach kontrolnych liczba żywych komórek SW480 w hipoksji była podobna jak komórek SW620, natomiast zarówno w normoksji tkankowej (10% tlenu), jak i atmosferycznej (21% tlenu) była znamiennie niższa (p< 0,001) (Ryc. 2).

W hipoksji liczba komórek SW480 i SW620 hodowanych w obecności każdego ze stężeń badanych związków nie różniła się istotnie, z wyjątkiem niższego stężenia HCA i wyższego mieszaniny (p<0,001).

W normoksji tkankowej w obecności niższych stężeń wszystkich antyoksydantów liczba komórek SW480 była znamiennie mniejsza niż komórek SW620. Przy wyższych stężeniach Q, EGCG oraz mieszaniny liczba komórek obu linii była podobna, natomiast w obecności ALA i HCA było więcej komórek SW480 niż SW620 (p<0,001).

W normoksji atmosferycznej szybkość proliferacji komórek SW480 w obecności niższych stężeń Q, EGCG i ALA była znamiennie mniejsze niż komórek SW620 (p<0,05, p<0,05 i p<0,001), natomiast w obecności HCA i mieszaniny znamiennie większa (p<0,001). Przy wyższych stężeniach badanych związków tylko Q istotnie wpływała na szybkość proliferacji każdej linii (p<0,001).

DYSKUSJA

Choroby nowotworowe charakteryzują się wysokim wskaźnikiem śmiertelności. W piśmiennictwie istnieje wiele danych dotyczących przeciwnowotworowego działania antyoksydantów, jednak większość badań na hodowlach komórkach prowadzona jest w niefizjologicznym stężeniu tlenu (21%). Ponadto wpływ działania różnych związków na komórki, bardzo często badany jest przy ich wysokich, przeważnie nieosiągalnych in vivo stężeniach [15]. Tlen jest ważnym czynnikiem regulującym przemiany metaboliczne w komórkach nowotworowych oraz wpływającym na wewnątrzkomórkowy poziom RFT. W warunkach fizjologicznych około 5% wdychanego tlenu ulega przekształceniu w RFT, które tylko w niewielkich stężeniach są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania komórki. W warunkach homeostazy, powstające w nadmiarze RFT są skutecznie usuwane dzięki działaniu enzymatycznych i nieenzymatycznych systemów antyoksydacyjnych. Obniżenie skuteczności tych systemów oraz wzrost ilości RFT prowadzą do powstania stresu oksydacyjnego, który może być przyczyną transformacji nowotworowej [16, 17]. RFT wytwarzane w nadmiarze przez komórkę nowotworową generują mutacje, które zwiększają ich zdolność przerzutowania i oporność na leki [12]. Chandel i wsp. [18] wykazali, że poziom RFT stabilizuje hipoksyjny czynnik HIF-1α, który reguluje angiogenezę, szlaki glikolizy i glutaminolizy oraz umożliwia adaptację komórki nowotworowej do warunków hipoksji. Jak wynika z piśmiennictwa pro- lub antynowotworowe działanie RFT w dużym stopniu zależy od ich stężenia w komórce. Według Sullivana i wsp. [12] niskie i wysokie stężenia RFT działają odpowiednio cytostatycznie i cytotoksycznie, podczas gdy stężenia pośrednie ułatwiają wzrost komórek nowotworowych.

Obserwowane w obecnej pracy hamowanie proliferacji obu linii komórkowych raka jelita grubego w hipoksji, w obecności zarówno pojedynczych antyoksydantów, jak i ich mieszaniny, może być przyczyną destabilizacji czynnika transkrypcyjnego HIF-1α spowodowanej bezpośrednim zmiataniem RFT, a także aktywacją enzymów antyoksydacyjnych [1−5, 8]. Wiadomo, że kwercetyna obniża działanie HIF-1α w komórkach HTC116 raka jelita grubego i komórkach MCF-7 raka piersi poprzez hamowanie szlaku sygnałowego AMPK (kinaza zależna od AMP) [19, 20]. HIF-1α zwiększa także ekspresję kinazy dehydrogenazy pirogronianowej (PDK), co prowadzi do zahamowania aktywności samej dehydrogenazy (PDH) i zmniejszenia wpływu kwasu α-liponowego (ALA) jako kofaktora reakcji [21]. ALA, podobnie jak kwas dichlorooctowy (DCA), jest inhibitorem kinazy dehydrogenazy pirogronianowej inaktywującej PDH [22]. Z piśmiennictwa wiadomo, że w liniach komórkowych glejaka, niedrobnokomórkowego raka płuc i raka gruczołu sutkowego, DCA hamuje proliferację i angiogenezę oraz indukuje apoptozę poprzez nasilenie mitochondrialnej syntezy RFT [23]. ALA wykazuje działanie analogicznie do DCA pod względem aktywacji PDH. Jednak ALA jest uniwersalnym zmiataczem RFT, co może tłumaczyć brak jego wpływu na proliferację komórek raka pierwotnego jelita grubego w normoksji tkankowej. Natomiast hamujące działanie wyższych stężeń tego związku na proliferację komórek przerzutowych, wskazuje na różnice w poziomie RFT w tych komórkach. Wiadomo, że w jelicie grubym poza łańcuchem oddechowym ważnym źródłem RFT jest zlokalizowana w błonie komórkowej oksydaza NADPH. Dahan i wsp. [24] wykazali niższą ekspresję Nox1 (katalityczna podjednostka oksydazy NADPH) w komórkach SW620 w porównaniu do komórek SW480, podczas gdy w warunkach normoksji tkankowej ekspresja cytozolowej izoformy SOD1 w komórkach SW620 była około 2-krotnie wyższa niż w komórkach SW480 [25]. Według badań prowadzonych przez Janssen i wsp. [26] ekspresja SOD1 na poziomie białka w przerzutach raka jelita grubego była wyższa w porównaniu do pierwotnego raka jelita grubego, natomiast ekspresja mitochondrialnej izoformy SOD2 była na podobna poziomie. W świetle tych danych uzyskana w obecnej pracy mniejsza liczba komórek SW620 w 10% stężeniu tlenu może być wynikiem osiągnięcia w komórce cytostatycznego stężenia RFT na skutek ich zmniejszonej syntezy i jednocześnie większego usuwania. Natomiast w komórkach linii SW480 większa ekspresja Nox1 i mniejsza ekspresja SOD1 powodują wzrost stężenia RFT, co może prowadzić do osiągnięcia zakresu stężeń promujących wzrost guza.

Większa wrażliwość komórek obu linii na działanie wyższych stężeń EGCG w normoksji tkankowej niż hipoksji może mieć również związek z różną aktywnością dehydrogenazy glutaminianowej (GDH). W hipoksji utrudniona regeneracja koenzymu reakcji (NAD+) w łańcuchu oddechowym, może obniżać aktywność GDH. Badania własne wykazały, że w 1% stężeniu tlenu główną rolę w przebiegu glutaminolizy odgrywa mitochondrialna izoforma aminotransferazy asparaginianowej (AST2) [27].

Spośród badanych związków HCA wykazuje najsłabsze właściwości antyoksydacyjne, dlatego obserwowany w jego obecności efekt antyproliferacyjny może mieć związek z hamującym wpływem na ATP-zależną liazę cytrynianową (ACL), która dostarcza acetyloCo-A do syntezy lipidów. Wiadomo, że hamowanie ekspresji i aktywności ACL zwalnia wzrost komórek nowotworowych [28]. Thompson i wsp. [29] stwierdzili, że wzrost komórek rakowych płuc, prostaty, wątroby związany z nadekspresją ACL może być hamowany w obecności inhibitorów farmakologicznych (SB-204990) tego enzymu lub przez wyciszenie genu ACL. W warunkach hipoksji ilość cytrynianu (substratu dla ACL) jest mniejsza niż w normoksji, co może tłumaczyć hamowanie proliferacji badanych komórek raka jelita grubego już w fizjologicznych stężeniach HCA. W 1% stężeniu tlenu aktywność PDH jest obniżona, dlatego cytrynian pochodzi głównie ze szlaku glutaminolizy, którego wydajność w hipoksji też jest ograniczona (zahamowanie czynnika transkrypcyjnego c-myc) [30,31]. Natomiast w normoksji tkankowej brak działania HCA na komórki SW480 (przy obu stężeniach) i SW620 (przy niższym stężeniu) może mieć związek ze wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu cytrynianu. Z kolei silnie hamujące działanie wyższego stężenia HCA na komórki SW620 być może związane z różnym poziomem ekspresji ACL w pierwotnym i przerzutowym raku jelita grubego. W fachowej literaturze brak danych na temat zmian ekspresji tego enzymu w zależności od dostępności tlenu. Warto zaznaczyć, że w warunkach normoksji tkankowej komórki linii SW620 wykazywały wysoką wrażliwość wobec badanych związków tylko w ich wyższych stężeniach, w przeciwieństwie do komórek SW480, gdzie efekt działania nie zależał od stężenia antyoksydantu.

Najmniejsza liczba komórek linii SW480 i SW620 obserwowana we wszystkich stężeniach tlenu pod wpływem mieszaniny wszystkich badanych związków jest zapewne związana z ich synergistycznym działaniem hamującym na metabolizm komórkowy. Badania prowadzone przez Schwrtz i wsp. [32] wykazały, że jednoczesne stosowanie HCA (200 µM) i ALA (4 µM) znacznie zmniejszało proliferację komórek raka jelita grubego (HT-29).

Uzyskane w obecnej pracy wyniki badań prowadzonych w 21% stężeniu tlenu wykazują większą dynamikę wzrostu komórek, co może wpływać na hamujący efekt badanych związków. Ponadto, dostępność tlenu ma istotny wpływ na wewnątrzkomórkowy poziom RFT, od których zależy potencjał proliferacyjny komórek nowotworowych. Odmienne wyniki uzyskane w hodowlach prowadzonych w 10% (występującym in vivo) i 21% (niefizjologicznym) stężeniu tlenu wskazują, że tlen jest istotnym czynnikiem, który musi być brany pod uwagę w badaniach wpływu antyoksydantów na komórki nowotworowe.

W świetle wyników uzyskanych w obecnej pracy można wnioskować, że suplementacja badanymi związkami może wspomagać leczenie pierwotnego i przerzutowego raka jelita grubego. Najsilniejsze działanie cytostatyczne wykazywał galusan epigallokatechiny występujący w dużych ilościach w herbacie zielonej oraz oolong.

W piśmiennictwie brak danych dotyczących leczniczego stosowania polifenoli zawartych w zielonej herbacie u pacjentów z rakiem jelita grubego. Natomiast wiadomo, że regularne przyjmowanie 2,5 g wyciągu z zielonej herbaty dziennie powodowało brak nawrotu polipów jelita grubego u około połowy (51,6%) pacjentów po zabiegu polipektomii [33]. W badaniach prowadzonych w Stanach Zjednoczonych stwierdzono, że spożywanie zielonej herbaty korelowało ze zmniejszonym ryzykiem rozwoju raka jelita grubego oraz piersi i prostaty. Dane uzyskane w badaniach epidemiologicznych wykazały zmniejszenie prawdopodobieństwa wystąpienia choroby nowotworowej u osób powyżej 40. roku życia przyjmujących 2,5 g wyciągu z zielonej herbaty (odpowiednik 10 filiżanek) na dobę [33, 34]. Ponadto stwierdzono, że spożywanie 3 filiżanek zielonej herbaty dziennie hamowało rozwój raka prostaty, zaś suplementacja EGCG (1200 mg na dobę) wspomagała działanie radioterapii u pacjentek z rakiem piersi [35, 36].

WNIOSKI

1. Badane antyoksydanty w stężeniach fizjologicznych nie zmniejszają przeżywalności komórek pierwotnego i przerzutowego raka jelita grubego, zatem doustna suplementacja badanymi związkami nie powoduje efektu cytotoksycznego.

2. Wszystkie badane antyoksydanty działają cytostatycznie w hipoksji na obie linie komórkowe. W normoksji tkankowej komórki przerzutowe proliferują wolniej w obecności każdego z badanych antyoksydantów, natomiast komórki raka pierwotnego są wrażliwe tylko na działanie EGCG, jednego z najbardziej rozpowszechnionych naturalnych flawonoidów.

3. Wyniki uzyskane w normoksji atmosferycznej różnią się od wyników w normoksji tkankowej, zatem nie odzwierciedlają procesów zachodzących in vivo.

PIŚMIENNICTWO

1. Carocho M, Ferreira IC. A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food Chem Toxicol. 2013;51:15–25.

2. Zhang M, Swarts SG, Yin L et al. Antioxidant properties of quercitin. Adv Exp Med Biol. 2011;701:283–289.

3. Liu H, Guo X, Chu Y et al. Heart protective effects and mechanism of quercetin preconditioning on anti-myocardial ischemia reperfusion (IR) injuries in rats. Gene. 2014;545(1):149–155.

4. Surapaneni KM, Jaini M. Comperative effect of piogitazone, quercetin and hydroxyl citric acid on the status of lipid peroxidation and antioxidants in experimental non-alcoholic steatohepatitis. J Physiol Pharmacol. 2014;65(1):67–74.

5. Forester SC, Lambert JD. Antioxidant effect of green tea. Mol Nutr Food Res. 2011;55(6):844–54.

6. Shim CK, Ceon EP, Kan KW et al. Inhibition effect of flavonoids on monocarboxylate transporter 1 (MCT1) in Caco-2 cells. J Pharm Pharmacol. 2007;59(11):1515–1519.

7. Li C, Allen A, Kwagh J et al. Green tea polyphenols modulate insulin secretion by inhibiting glutamate dehydrogenase. J Biol Chem. 2006;281(15):10214–10221.

8. Shay KP, Moreau RF, Smith EJ et al. Alpha-lipoic acid as a dietary supplement: molecular mechanisms and therapeutic potential. Biochim Biophys Acta. 2009;1790(10):1149–1160.

9. Packer L, Witt EH, Tritschler HJ. alpha-Lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic Biol Med. 1995;19(2):1149–1160.

10. Panda V, Ashar H, Srinath S. Antioxidant and hepatoprotective effect of Garcinia indica fruit rind in ethanol-induced hepatic damage in rodents. Interdiscip Toxicol. 2012;5(4):207–213.

11. Jena BS, Jayaprakasha GK, Singh RP el al. Chemistry and biochemistry of (-)-hydroxycitric acid from Garcinia. J Agric Food Chem. 2002;50(1):10–22.

12. Sullivan LB, Chandel NS. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer Metab. 2014;2:17–29.

13. Carreau A, El Hafny-Rahbi B, Matejuk A et al. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? J Cell Mol Med. 2011;15(6)1239–1253.

14. Manach C, Williamson G, Morad C et al. Bioavailability and bioefficiency of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr. 2005;81(Suppl 2):S230–S242.

15. Fantini M, Benvenuto M, Masuelli L et al. In Vitro and in Vivo Antitumoral Effects of Combinations of Polyphenols, or Polyphenols and Anticancer Drugs: Perspectives on Cancer Treatment. Int J Mol Sci. 2015;16:9236–9282.

16. Ścibior-Bentkowska D, Czeczot H. Komórki nowotworowe a stres oksydacyjny. Postepy Hig Med Dosw. 2009;63:58–72.

17. Kalisz O, Wolski T, Gerkowicz M et al. Reaktywne formy tlenu (RTF) oraz ich rola w patogenezie niektórych chorób. Annales UMSC. 2007;62(1):89–96.

18. Chandel NS, McClintock DS, Feliciano CE et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: a mechanism of O2 sensing. J Biol Chem 2000;275(33):25130–25138.

19. Lee YK, Park OJ. Involvement of AMPK/mTOR/HIF-1α in anticancer control of quercetin in hypoxic MCF-7 cells. Food Sci Biotechnol. 2011;20(2):371–375.

20. Kim HS, Wannatung T, Lee S et al. Quercetin enhances hypoxia-mediated apoptosis via direct inhibition of AMPK activity in HCT116 colon cancer. Apoptosis. 2012;17(9):938–949.

21. Kim JW, Tchernyshyov I, Semenza GL et al. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 2006;3(3):177–185.

22. Korotchna LG, Sidhu S, Patel MS. R-lipoic acid inhibits mammalian pyruvate dehydrogenase kinase. Free Radic Res. 2004;38(10):1083–1092.

23. Kankotia S, Stacpoole PW. Dichloroacetate and cancer: new home for an orphan drug? 2014;1846(2):617–629.

24. Dahan L, Sedok A, Formento JL et al. Modulation of cellular redox state underlies antagonism between oxaliplatin and cetuximab in human colorectal cancer cell lines. Br J Pharmacol. 2009;158(2):610–620.

25. Skrzycki M, Czeczot H, Mielczarek-Puta M et al. Effect of different concenrtation of oxygen on expression of sigma 1 receptor and superoxide dismutases in human colon adenocarcinoma cell lines. J Recept Signal Transduct Res. 2017;37(3):252–258.

26. Janssen AM, Bosman CB, Kruidenier L et al. Superoxide dismutases in the human colorectal cancer sequence. J Cancer Res Clin Oncol. 1999;125(6):327–35.

27. Grabon W, Otto-Ślusarczyk D. Chrzanowska A et al. Lactate formation in primary and metastatic colon cancer cells at hypoxia and normoxia. Cell Biochem Funct 2016;34(7):483–490.

28. Khwairakpam AD, Shyamananda MS, Sailo BL et al. ATP citrate lyase (ACLY): a promising target for cancer prevention and treatment. Curr Drug Targets. 2015;16(2):156–163.

29. Hatzivassiliou G, Zhao F, Bauer DE et al. ATP citrate lyase inhibition can suppress tumor cell growth. Cancer Cell. 2005;8(4):311–321.

30. Zhang H, Gao P, Fukada R et al. HIF-1 infibits mitochondrial biogenesis and cellular respiration in VHL – deficient renal cell carcinoma by repression of C-MYC activity. Cancer Cell. 2007;11(5):407–420.

31. Wise DR, DeBerardinis RJ Mancuso A et al. Myc regulates a transcriptional program that stimulates mitochondrial glutaminolysis and lead to glutamine addicion. Proc Natal Acad Sci USA. 2008;105(48):18782–18787.

32. Schwarz L, Abolhassani M, Guais A et al. A combination of alpha lipoic acid and calcium hydroxycitrate is efficient against mouse cancer models: preliminary results. Oncol Rep. 2010;23(5):1407–1416.

33. Fujiki H, Sueoka E, Watanabe T et al. Synergistic enhancement of anticancer effects on numerous human cancer cell lines treated with the combination of EGCG, other green tea catechins, and anticancer compounds. J Cancer Res Clin Oncol. 2015; 141(9):1511–1522.

34. Johnson JJ, Bailey HH, Mukhtar H. Green tea polyphenols for prostate cancer chemoprevention: A translational perspective. Phytomedicine 2010;17(1):1–13.

35. Jian L, Xie LP, Lee AH, Binns CW. Protective effect of green tea against prostate cancer: a case-control study in southeast China. Int J Cancer. 2004;108(1):130–135.

36. Zhang G, Wang Y, Zhang Y. Anti-cancer activities of tea epigallocatechin-3-gallate in breast cancer parients under radiotherapy. Curr Mol Med. 2012;12(2):163–176.

Adres do korespondencji:

Magdalena Mielczarek-Puta

Katedra i Zakład Biochemii Warszawski Uniwersytet Medyczny

ul: Banacha 1, 02-097 Warszawa;

e-mail: mmielczarek@wum.edu.pl

Nadesłano: 19.07.2017

Zaakceptowano: 03.11.2017

Q, kwercetyna; EGCG, galusan epigallokatechiny; ALA, kwas α-liponowy; HCA, kwas hydroksycytrynowy; QEAH1, mieszanina związków w niższych stężeniach; QEAH2, mieszanina związków w wyższych stężeniach. **P<0,001; *P<0,05 wobec kontroli

Ryc.1. Wpływ antyoksydantów na proliferację komórek SW480 i SW620 w różnym stężeniu tlenu

Wyniki analizowano metodą ANOVA, jak podano w Materiałach i metodach. Skróty jak na ryc.1

czarny trójkąt – komórki SW480

czarny kwadrat – komórki SW620

Ryc.2. Zależność proliferacji komórek SW480 i SW620 od stężenia tlenu w obecności badanych antyoksydantów.