THE CHALLENGES OF DRUG DISCOVERY: DESIGN OF SELECTIVE JAK INHIBITORS FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISORDERS

Wyzwania w odkrywaniu nowych leków
– projektowanie selektywnych inhibitorów
JAK kinaz do leczenia chorób autoimmunizacyjnych

Zygmunt S. Derewenda

UNIVERSITY OF VIRGINIA, SCHOOL OF MEDICINE, CHARLOTTESVILLE VA, USA

ABSTRACT

Protein kinases constitute a critically important family of drug targets, along with GPCRs (G-protein coupled receptors) and ion channels. There are 518 Tyr and Ser/Thr kinases encoded in the human genome, and collectively known as the kinome. To date, more than 40 kinase inhibitors have been approved by the Food and Drug Administration (USA) and the European Medicines Agency (EMA) for clinical use, mostly targeting tumors and leukemia. Recently, two drugs have been approved for the treatment of rheumatoid arthritis (RA), as selective inhibitors of JAK kinases [1]: Tofacitinib (FDA, EMA) and Baricitinib (EMA), shown in Fig. 1. Interestingly, FDA rejected approval of Baricitinib in April 2017, citing concerns about dosing and safety. Earlier, in 2010, Ruxotilinib, a selective JAK1/2 inhibitor has been approved for use against myeloproliferative neoplasms and psoriasis.

Design of selective inhibitors targeting specific kinases is a challenge, because all protein kinases share the same fold of the catalytic domain, and the highly similar ATP-binding site is the most accessible pocket that can be targeted by a small-molecule inhibitor. There are three classes of kinase inhibitors: 1. those that bind to active conformation; (2) those that bind to a non-active conformation unique to a specific kinase; 2. those that bind outside the ATP-site, within allosteric sites. Most known inhibitors are type II inhibitors, and have been discovered through laborious and costly screening process. While many are successful in the clinic, the selectivity and specificity is often sub-optimal. The process of drug discovery and optimization is greatly enhanced by the use of X-ray diffraction crystallography which allows for direct visualization of how inhibitors bind to kinases at atomic or nearly atomic resolution. The structures of both Tofacitinib and Baricitinib bound to kinases have been determined by X-ray crystallography, although not in complexes with JAK kinases. Tofacitinib has been studied in complex with the PRK1 kinase [2], while Baricitinib was studied in complex with the BMP-2 inducible kinase [3]. These crystal structures offer insights into the molecular mechanisms by which JAK kinases are preferentially inhibited by these compounds. Importantly, efforts are underway to develop more potent pan-JAK inhibitors, for inhaled and topical delivery in treatment on inflammatory diseases and structural data for those compounds (now in clinical trials) are available (Fig. 2.) [4]. In my presentation I will explain how X-ray crystallography has helped in the drug discovery process and I will discuss the implication of these ongoing studies of JAK inhibitors.

Key words: drug discovery, JAK kinases inhibitors, X-ray crystallography

Słowa kluczowe: odkrywanie leków, inhibitory kinaz JAK, krystalografia

References:

1. O’Shea JJ, Kontzias A., Yamaoka K, Tanaka, Y, Laurence, A. Ann Rheum Dis 2013;72(Suppl 2):ii111-5.

2. Chamberlain P, Delker S, Pagarigan B, Mahmoudi A, Jackson P, Abbasian M, Muir J, Raheja N, Cathers B. PLoS One 2014;9:e103638.

3. Sorrell FJ, Szklarz M., Abdul Azeez KR, Elkins JM Knapp S. Structure 2016;24:401-11.

4. Jones P et al.. J Med Chem 2017;60:767-786.

ENDOGENOUS AND EXOGENOUS DANGER SIGNALS IN THE PATHOGENESIS OF SJÖGREN’S SYNDROME

Endogenne i egzogenne sygnały zagrożenia w patogenezie zespołu SjÖgrena

Umesh S. Deshmukh

OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FUNDATION, USA

ABSTRACT

Sjögren’s syndrome (SS) is a chronic autoimmune disorder mainly affecting the exocrine salivary and lacrimal glands. A destructive immune response against these tissues is responsible for the reduced fluid secretion, which manifests in to the dry mouth and dry eye symptoms of this disorder. It now accepted that interaction between the innate and adaptive immunity is critical for the pathogenesis of SS.

The role of innate immunity in SS is highlighted by the fact that many patients with SS present with a heightened type I interferon (IFN) response. The production of type I IFNs is generally induced by the activation of nucleic acid sensors within the cells. They include endosomal Toll-like receptors (TLR3, TLR7 and TLR9), cytosolic RNA sensors (RIG-I, MDA5) and a multitude of cytosolic DNA sensors (DDX41, MRE11, DAI, IFIX, IFI16, cGAS, LRRF1P1, KU70, DHX9 and AIM2). These sensors are generally activated by exogenous signals from bacterial and viral nucleic acids. However, under certain situations, the accumulation of self-nucleic acids within the cell is construed as a danger signal and it causes the activation of these nucleic acid sensors.

Over the past few years our laboratory has been investigating the role of type I IFN in SS pathogenesis. We have used poly(IC), a dsRNA molecule to activate endosomal TLR3 and cytosolic RNA sensor RIG-I. Our studies show that poly (IC) induced type I IFN production causes a rapid and acute salivary gland hypofunction in different strains of mice. In mice, genetically susceptible for the development of SS, poly(IC) treatment causes more severe and accelerated salivary gland inflammation.

To activate the cytosolic DNA sensor pathway, we have used the compound DMXAA, which binds the stimulator of interferon gene (STING) protein. Our studies show that DMXAA treatment rapidly upregulated the expression of Ifnb and pro-inflammatory cytokines, both systemically and locally in the salivary glands. Within 4 weeks, in comparison with the vehicle treated mice, DMXAA treated mice developed significantly higher incidence of sialoadenitis. The inflammatory cell infiltrates were mainly composed of CD4+T cells and F4/80+ activated macrophages. At early stages of the disease, significantly increased numbers of NK1.1+ type I innate lymphoid cells were observed in the salivary glands. The mean saliva volume in DMXAA treated group was significantly lower than the untreated and vehicle treated group, which is indicative of glandular hypofunction.

Our laboratory is also investigating the role of inflammasome pathway in pathogenesis of SS. Activation of inflammasome leads to the production of IL1-b and IL-18. Both of these cytokines are elevated in SS patients. To activate the inflammasome pathway we have used the adjuvant Alum, which contains aluminum hydroxide. Our studies show that alum adjuvant induces a SS-like disease in mice genetically susceptible for the development of SS. Further we have also demonstrated that activation of innate immunity by alum plays a critical role in the ability of autoantibodies to induce salivary gland dysfunction.

The lecture will discuss the mechanisms and the role of exogenous and endogenous triggers involved in the activation of innate immunity in SS.

Key words: Sjögren’s syndrome, danger signals, innate immunity

Słowa kluczowe: zespół Sjögrena, synały alarmowe, odporność wrodzona

POSTRANSLACYJNIE MODYFIKOWANE BIAŁKA
– ŹRÓDŁO ANTYGENÓW DLA PRZECIWCIAŁ MARKEROWYCH
W REUMATOIDALNYM ZAPALENIU STAWÓW

Post-translational protein modifications – the source of rheumatoid arthritis marker antibodies

Bogdan Kolarz1, Maria Majdan2

1WYDZIAŁ MEDYCZNY, UNIWERSYTET RZESZOWSKI, RZESZÓW, POLSKA

2KLINIKA REUMATOLOGII I UKŁADOWYCH CHORÓB TKANKI ŁĄCZNEJ, UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, LUBLIN, POLSKA

STRESZCZENIE

Posttranslacyjna modyfikacja białek może zachodzić z wykorzystaniem różnych mechanizmów. Jeden z nich polega na enzymatycznym przekształceniu argininy w cytrulinę. Enzymem odpowiedzialnym za tę reakcję jest deiminaza peptydyloargininowa typu IV (PADI-4 Peptidyl Arginine Deiminase, type IV –). W efekcie powstają białka cytrulinowane, stanowiące nieznany dla układu immunologicznego epitop, który indukuje syntezę przeciwciał przeciw cytrulinowanym białkom (ACPA − anti-citrullinated protein autoantibodies). Najważniejsze białka poddawane procesowi cytrulinacji mające znaczenie dla rozwoju RZS to filagryna, α-enolaza, fibrynogen typu I i II, fibronektyna, białko szoku cieplnego 90, białko wiążące łańcuchy ciężkie immunoglobulin i inne. Tylko izotop IgG ACPA ma znaczenie w diagnostyce RZS. Wymieniony powyżej enzym PADI4 także może stać się antygenem i indukować powstawanie przeciwciał badanych pod kątem użyteczności we wczesnej diagnostyce RZS. Podobnie jak wcześniej opisane przeciwciała, także anty-PADI4 mogą być wykrywane zanim wystąpią objawy choroby. Ich obecność wiąże się później z zaawansowaniem zmian radiologicznych oraz ryzykiem oporności na leczenie inhibitorami TNF. Obserwowany jest także proces autocytrulinacji PADI4, lecz znaczenie tego zjawiska nie jest jasne i wymaga dalszych badań. Innymi przeciwciałami badanymi w kontekście użyteczności w diagnostyce RZS są przeciwciała skierowane przeciw białkom karbamylowanym (anti-CarP – antibodies against carbamylated proteins), nazywane także przeciwciałami anty-homocytrulinowanymi. Karbamylacja to proces posttranslacyjnej modyfikacji białek. Nie wymaga on jednak udziału enzymów, a jest zjawiskiem chemicznym. Polega na przyłączeniu do białek reszt karbamoilowych, wywodzących się z kwasu izocjanowego. Tego typu reakcja w pozycji ε lizyny prowadzi do powstania ε-karbamylowanej lizyny nazywanej homocytruliną. W efekcie zachodzi zmiana właściwości antygenowych wielu białek, między innymi metaloproteinaz 2, kolagenu typu I, tkankowego inhibitora metaloproteinaz, a także fibrynogenu, vimentyny i enolazy. Najstarszym i najlepiej poznanym przeciwciałem mającym uznane miejsce w diagnostyce RZS jest czynnik reumatoidalny (RF − Rheumatic Factor). Jest to autoprzeciwciało skierowane przeciwko domenie Cγ2-Cγ3 w regionie Fc immunoglobulin G. Monomery IgG stanowią jednak niezwykle słaby antygen dla RF. Stwierdzany w RZS RF jest w istocie przeciwciałem skierowanym przeciw kompleksom immunologicznym (ICs − Immunological Complexes), a dokładnie przeciwko wspomnianym odcinkom Fc IgG w połączeniu z różnymi białkami. Najczęściej stwierdzanymi proteinami wchodzącymi w skład ICs są wymienione powyżej posttranslacyjnie zmodyfikowane białka – cytrulinowane, karbamylowane lub inne. Czynnik reumatoidalny stwierdzany w RZS jest identyczny z tym powstającym w przewlekłych procesach infekcyjnych, co może rzucać światło na pochodzenie jednego z najważniejszych markerów RZS oraz etiopatogenetyczne wyjaśnienie roli posttranslacyjnych modyfikacji białek zaangażowanych w inicjację i podtrzymanie RZS. Kompleksy RF-IgM/ICs inicjują aktywację dopełniacza oraz wytwarzanie mediatorów zapalenia. Zdolności takiej nie posiadają ACPA. Białka cytrulinowane wchodząc w skład ICs pośrednio mogą jednak przyczyniać się do inicjacji procesu zapalnego z wykorzystaniem RF. Głównym źródłem posttranslacyjnie modyfikowanych białek może być NEToza, jeden z rodzajów śmierci komórek, któremu podlegają granulocyty obojętnochłonne w pierwszych etapach obrony organizmu przed zakażeniami bakteryjnymi. Polega ona na wytworzeniu przez neutrofile rodzaju zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofilowej (NETs − Neutrophil Extracellular Traps). Ma ona na celu unieruchomienie i neutralizację drobnoustrojów oraz zapobieżenie ich rozprzestrzenianiu. W trakcie tego zjawiska dochodzi do wypchnięcia z neutrofili zdekondensowanej chromatyny, histonów oraz licznych białek o właściwościach bakteriobójczych (m.in. elastazy, mieloperksydazy, proteinazy 3, katepsyny, laktoferyny, metaloproteinaz 9), co tworzy sieć wokół neutrofili. Jednym z dodatkowych następstw jest uwolnienie licznych cytrulinowanych oraz karbamylowanych białek, które potem stają się źródłem antygenów dla powstających przeciwciał, w tym także RF. RZS to choroba o podłożu autoimmunizacyjnym, dlatego największe znaczenie w jej diagnostyce mają różnego typu przeciwciała. Problem zapoczątkowania syntezy samych przeciwciał markerowych oraz ich rola w patogenezie choroby pozostaje kwestią niewyjaśnioną. Podobnie dalszych badań wymaga ustalenie roli zakażeń i NETs w etiologii RZS i indukcji syntezy różnych przeciwciał.

Key words: post- translational protein modifications, antibodies, rheumatoid arthritis

Słowa kluczowe: postranslacyjnie modyfikowane białka, przeciwciała, reumatoidalne zapalenie stawów

Fig. 1. The chemical structures of Baricitinib (left) and Tofacitinib (right).

Fig. 2. The crystal structure of the JAK2 kinase domain in complex with a new pan-specific inhibitor (PDB code 5TQ8).